第一法 金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)

1、7.5%氯化鈉肉湯增菌培養(yǎng)：

（1）若樣品本身在均質(zhì)后清澈，培養(yǎng)18h觀察呈現(xiàn)一定程度的渾濁（與培養(yǎng)前相比），則接種平板；若18h后仍無變化，繼續(xù)培養(yǎng)至24h后無論渾濁與否都接種至平板；

（2）若樣品本身在均質(zhì)后渾濁，則直接培養(yǎng)至24h后再接種平板。

2、血平板：

36±1℃培養(yǎng)18h后觀察，若有菌落生長或有菌落生長的跡象（無論是否溶血），則應(yīng)酌情配制NA、BHI并分裝至小試管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、滅菌后NA應(yīng)斜放凝固成瓊脂斜面?zhèn)溆?。至血平板培養(yǎng)至24h取出，挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，同時(shí)挑取菌落接種至NA斜面、BHI肉湯管，36±1℃培養(yǎng)24h。

3、接種原則：

（1）革蘭氏染色后還剩余10個(gè)或10個(gè)以上菌落，則NA、BHI分別接種5管；

（2）若多于5個(gè)（不包括5個(gè)）不足10個(gè)，則BHI接種5管，剩余的接種NA；

（3）5個(gè)及以下則全部接種BHI，不接種NA。

4、BP平板：

36±1℃培養(yǎng)24h后觀察，有菌落生長則取出，無菌落生長則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察。若血平板已挑取菌落進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，則不必再挑取BP平板上的菌落進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 若血平板上無菌落生長，則應(yīng)在24h～48h內(nèi)逐步觀察BP平板是否長菌或有無長菌跡象，有則需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落進(jìn)行純化、增菌，36±1℃培養(yǎng)24h。

5、血漿凝固酶試驗(yàn)：

（1）根據(jù)BHI管數(shù)，取凍干血漿粉，每瓶用移液槍加入0.5mL生理鹽水，使其充分溶解，再換移液槍槍頭取0.3mLBHI培養(yǎng)物加入其中（每管BHI用1個(gè)槍頭），振蕩搖勻后于36±1℃培養(yǎng)，計(jì)時(shí)，每30min觀察一次，如呈現(xiàn)凝固（將試管傾斜或倒置時(shí)出現(xiàn)凝塊）或半凝固（一般的液體呈現(xiàn)凝固）則判定為陽性。若一直不凝固，則一直觀察，直至觀察至6h（查看12次）還未凝固，則試驗(yàn)終止，判定為陰性結(jié)果；若中途出現(xiàn)完全凝固或半凝固，則試驗(yàn)終止，判定為陽性結(jié)果。

（2）同時(shí)取金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌懸液后作為陽性對(duì)照、以滅菌生理鹽水為陰性對(duì)照，分別接種至BHI中同步培養(yǎng)后進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。

（3）若血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果可疑，則挑取NA上的菌落接種BHI再次進(jìn)行試驗(yàn)。

第二法 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法

1、取1mL樣品稀釋勻液接種3個(gè)BP平板（此處并未嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)中0.3mL、0.3mL、0.4mL精確取樣，由于如此操作會(huì)增加試驗(yàn)時(shí)間，無法在15min內(nèi)完成試驗(yàn)）。

2、涂布時(shí)不要觸及平板邊緣（會(huì)導(dǎo)致樣液涂抹不均勻，大部分匯集于邊緣）。

3、可用同一根涂布棒從低稀釋度到高稀釋度進(jìn)行涂布（不用換涂布棒）。

4、涂布完成后應(yīng)稍微放置一段時(shí)間使培養(yǎng)基吸收樣品勻液。

5、若水珠較多，可正置于培養(yǎng)箱中1～2h后再倒置培養(yǎng)。

6、36±1℃培養(yǎng)24h后觀察，有典型菌落生長則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)（革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)、劃線血平板）。若無菌落生長則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察，有典型菌落生長則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，無典型菌落生長則試驗(yàn)終止。

第三法 金黃色葡萄球菌MPN計(jì)數(shù)法

1、樣品稀釋同菌落總數(shù)，取3個(gè)連續(xù)稀釋度稀釋液（或包括液體樣品原液），每個(gè)稀釋度接種3管7.5%氯化鈉肉湯，每管接種1mL，36±1℃培養(yǎng)18h后觀察，若出現(xiàn)渾濁則接種至BP平板，若無變化則繼續(xù)培養(yǎng)至24h后再接種至BP平板。

2、劃線接種至BP平板，36±1℃培養(yǎng)24h后觀察，有典型菌落生長則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)（革蘭氏染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)、劃線血平板）。若無菌落生長則繼續(xù)培養(yǎng)至48h后再觀察，有典型菌落生長則進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，無典型菌落生長則試驗(yàn)終止。

3、根據(jù)證實(shí)后的陽性管數(shù)差MPN表得出結(jié)果。

GB 4789.4-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)

（標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)充）

1、稱取25g樣品于可封口的均質(zhì)袋中，再倒入BPW至250g，盡量排去均質(zhì)袋中的空氣后再封口、均質(zhì)后直接置于36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（標(biāo)準(zhǔn)要求為8～18h，一般培養(yǎng)過夜后第二天早晨繼續(xù)下一步試驗(yàn)）

2、TTB、SC應(yīng)酌情配制，現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置。若BPW放入培養(yǎng)箱的當(dāng)日時(shí)間允許，則可將TTB、SC滅菌、配制、分裝后冷藏以備第二天實(shí)驗(yàn)；若當(dāng)日時(shí)間不允許，則次日早晨滅菌、分裝，下午即可轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。

3、TTB：滅菌條件為121℃15min，與一般試驗(yàn)耗材、培養(yǎng)基的滅菌條件一致，故在滅菌時(shí)可考慮同時(shí)滅為一鍋。且須同時(shí)滅一些帶塞（可帶塑料蓋子）的小試管、10mL移液槍槍頭、1mL移液槍槍頭，在滅菌完成后溫度降至不燙手時(shí)，輕輕晃動(dòng)三角燒瓶使底部白色沉淀物浮起而充分混勻，每100mLTTB中加入1支碘液（陸橋，P-72）、1支0.1%煌綠（陸橋，P-73），充分搖勻至整瓶TTB呈現(xiàn)綠色，此時(shí)用移液槍準(zhǔn)確吸取10mLTTB至已滅菌的小試管中，蓋上蓋子。取1mLBPW增菌液至1管TTB中，于42℃培養(yǎng)18～24h（若時(shí)間允許、或18h后觀察試管仍無渾濁，則培養(yǎng)至24h，否則培養(yǎng)至18h即可）。

4、SC：僅需加熱煮沸滅菌（因SC易溶于水，煮沸即可，無需過度加熱），冷卻至不燙手時(shí)用移液槍吸取10mL分裝至已滅菌的小試管中，蓋上蓋子。取1mLBPW增菌液至1管SC中，于36±1℃培養(yǎng)18～24h（若時(shí)間允許、或18h后觀察試管仍無渾濁，則培養(yǎng)至24h，否則培養(yǎng)至18h即可）。

5、BS、XLD應(yīng)酌情配制，在用前一天配制后備用（兩者僅需加熱滅菌、不添加任何添加劑，無需過度加熱）。BS在不燙手時(shí)即可倒成平板，否則容易沉淀或凝固，且在倒平板前應(yīng)充分搖勻以防止有效成分沉淀于底部（棕色或棕黃色顆粒物）。XLD過度加熱會(huì)造成瓊脂不易凝固、劃線時(shí)容易劃破，甚至不凝結(jié)成塊、無法倒置。

6、XLD培養(yǎng)條件：36±1℃培養(yǎng)18～24h。18h后觀察，若TTB、SC增菌液都有菌落生長，則可挑取任意生長良好的菌落進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)；若只有其中一種增菌液有菌落生長、或兩者都無菌落生長，則繼續(xù)培養(yǎng)至24h再觀察，此時(shí)無論菌落生長與否都不再繼續(xù)培養(yǎng)，只要其中任一增菌液有典型或可疑沙門氏菌生長則挑取進(jìn)行生化試驗(yàn)。

7、生化鑒定：

（1）一般情況下，XLD上的任一增菌液長菌，則BS上對(duì)應(yīng)增菌液也會(huì)長菌，此時(shí)若已挑取XLD上的菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)，則無需挑取BS上的菌落；或XLD上的兩種增菌液長了形態(tài)特征完全相同的菌落，則挑取任一典型菌落進(jìn)行生化鑒定即可，且無論BS上菌落生長如何，都不再挑取BS上的菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)。

（2）若出現(xiàn)XLD未長菌的增菌液在BS上長菌，則還需挑取BS上的該菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)。

（3）用生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定，依據(jù)產(chǎn)品說明書判斷陰性或陽性，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中表2～表5的內(nèi)容逐步進(jìn)行判定（即生化鑒定試劑盒是將標(biāo)準(zhǔn)中的所有鑒定步驟同時(shí)完成，但判定時(shí)依然要按照標(biāo)準(zhǔn)逐步判定，只要其中任一階段可判定為非沙門氏菌屬，則不再往下判定，鑒定試驗(yàn)即終止）

（4）若判定為沙門氏菌屬，則可選擇進(jìn)行或不進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。首先應(yīng)確定該菌落無自凝性，否則無法進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。

本文轉(zhuǎn)載自微信公眾號(hào)食品微生物檢測(cè)。